单细胞转录组测序（scRNA-seq）让我们能在单个细胞分辨率下刻画组织的细胞组成与状态。相比 bulk RNA-seq，它的分析更复杂、坑也更多。本文以 10x Genomics 数据为例，把标准流程讲清楚。
流程总览
从 Cell Ranger 输出的表达矩阵开始，典型流程是：质控 → 归一化 → 高变基因 → 降维 → 聚类 → 注释。下面逐步拆解，并用 Seurat 举例。
第一步：质控与双胞过滤
原始矩阵里混着空液滴、破损细胞和双胞（一个液滴包了两个细胞）。常用三个指标过滤：
- nFeature_RNA（每个细胞检测到的基因数）：过低是空液滴或破损细胞，过高常是双胞；
- nCount_RNA（UMI 总数）：同理设上下限；
- 线粒体基因比例（percent.mt）：比例过高（如 > 10–20%，依组织而定）说明细胞已破损、胞质 RNA 流失。
阈值没有万能值。不同组织、不同解离方案差异很大——务必先看分布图再定切点，别照搬教程里的数字。
双胞还可以用 DoubletFinder、scrublet 等专门工具基于模拟双胞进一步识别，比单纯卡 nFeature 上限更可靠。
library(Seurat)
seu <- CreateSeuratObject(counts, min.cells = 3, min.features = 200)
seu[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(seu, pattern = "^MT-")
seu <- subset(seu, nFeature_RNA > 500 & nFeature_RNA < 5000 & percent.mt < 15)第二步：归一化与高变基因
测序深度在细胞间差异很大，需先归一化（LogNormalize 或更稳健的 SCTransform）。随后挑选 2000 个左右高变基因（HVG）——这些基因承载了细胞间的主要差异，后续降维只用它们，既降噪又提速。
第三步：降维与聚类
先用 PCA 把高变基因压缩到几十个主成分，再基于主成分做：
- UMAP / t-SNE：二维可视化，把细胞"摊"到平面上看群体结构；
- 图聚类（Louvain/Leiden）：在 KNN 图上聚类得到细胞簇。
关键参数是聚类分辨率（resolution）：调高分得细、调低分得粗。没有"正确值"，要结合 marker 是否清晰、生物学是否讲得通来定。
seu <- NormalizeData(seu) |> FindVariableFeatures() |> ScaleData()
seu <- RunPCA(seu) |> RunUMAP(dims = 1:30)
seu <- FindNeighbors(seu, dims = 1:30) |> FindClusters(resolution = 0.5)第四步：marker 鉴定与细胞注释
对每个簇做差异表达，找出特异高表达的 marker 基因，再结合已知标志物或参考图谱给簇命名（如 CD3D→T 细胞、CD79A→B 细胞）。也可以用 SingleR、CellTypist 等自动注释工具先打底，再人工校正。注释是单细胞分析里最考验生物学背景的一步。
常见误区
- 过度聚类：分辨率拉太高，把一个细胞类型的连续状态硬切成多个"假"簇；
- 忽视批次效应：多样本直接合并，结果按样本而非细胞类型聚类。需用 Harmony、Seurat integration 或 scVI 做整合；
- 线粒体阈值一刀切：心肌、肝等高代谢组织本底线粒体就高，套用通用阈值会误删真细胞；
- 只看 UMAP 距离下结论：UMAP 的簇间距离不代表真实相似度，定量比较要回到表达和聚类层面。
单细胞分析的难点不在跑通流程，而在每一步的参数判断与生物学解读。如果你有 scRNA-seq、单细胞 ATAC 或空间转录组数据需要分析——从标准流程到轨迹推断、细胞通讯、跨样本整合，欢迎联系我们。